RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA PREMIO “GENDER INNVATION”
Dott.ssa Giulia Sita
(Università di Bologna)
Relazione sull’attività scientifica all’estero della Dott.ssa Giulia Sita
Istituto Ospitante: Brain and Mind Research Istitute, Weill Cornell Medical College, New York, NY, USA. Istituto di Provenienza: FaBit Department, University of Bologna, Bologna.
Titolo del progetto di ricerca: Meccanismi di Neurodegenerazione e strategie di Neuroprotezione nelle patologie neurodegenerative
Nel corso del II anno di Dottorato, svolto nei laboratori del Professor Costantino Iadecola presso il Dipartimento Brain and Mind Research del Weill Cornell Medical College di New York, sono stati studiati i meccanismi di neurodegenerazione secondaria e le strategie di neuroprotezione in seguito ad un danno di tipo ischemico cerebrale.
Lo studio ha utilizzato un modello murino (C57BL6) di Ischemia Cerebrale in cui la lesione è stata indotta mediante l’occlusione dell’arteria mediana cerebrale (MCAO) per 23 minuti. In questo modo è stato possibile ottenere un danno molto simile a quello più frequentemente riscontrato nei casi di ischemia cerebrale umana (1).
Il processo ischemico cerebrale determina l’attivazione della cascata infiammatoria, negli animali come nell’uomo, in seguito a MCAO viene a verificarsi l’adesione dei leucociti circolanti alle cellule endoteliali cerebrali, che a loro volta migrano attraverso la parete dei vasi sanguigni per infiltrarsi nel tessuto che ha subito la lesione e allo stesso tempo anche astrociti e microglia risultano essere attivati. Questa cascata di eventi cellulari viene condotta dall’espressione di molecole di adesione e citochine iniziate dall’espressione del fattore nucleare di trascrizione κB (NF-κB). Benché molti studi abbiamo dimostrato che la riduzione dell’infiammazione postischemica sia di beneficio nello stroke sperimentale, la terapia iniziale a base di inibitori di queste molecole di adesione risulta essere fallimentare. Questo ha portato alla luce la complessità della risposta immunitaria indotta da ischemia cerebrale e la necessità di comprendere meglio come questo processo abbia inizio (2).
Il recettore di tipo B scavenger CD36, partecipa in molteplici funzioni cellulari. In particolare CD36 riconosce patterns molecolari patogeno-associati e induce una risposta infiammatoria attraverso l’attivazione di NF-κB. Questo recettore rimane coinvolto anche nei meccanismi dell’ischemia cerebrale, in quanto in seguito ad MCAO, il recettore viene attivato e gli animali knockout presentano un infarto cerebrale di minore estensione e un migliore outcome neurologico nello studio a breve termine. Queste osservazioni danno modo di credere che CD36 riconosca il tessuto danneggiato e sia il responsabile dell’iniziazione genica della cascata infiammatoria nonché abbia un ruolo nell’infiltrazione leucocitaria neutrofila e nell’attivazione della glia (3).
In questo anno si è voluto indagare quale sia il ruolo del suddetto recettore nella risposta a lungo termine dopo l’evento ischemico. A tale scopo il progetto ha visto impiegati quattro gruppi sperimentali: wild type, CD36 (-/-), sham wild type e sham CD36 (-/-).
Dopo la lesione sugli animali sono state effettuate 6 settimane di test comportamentali. I test sono stati scelti da un ampio spettro di ipotesi e valutati in relazione a quali potessero risultare più efficienti nella valutazione del danno indotto e dell’eventuale recupero, sia in ambito motorio che cognitivo (4).
A questo scopo i test motori sono stati eseguiti quattro giorni dopo l’operazione e successivamente a scadenza settimanale per sei settimane. Tali test comprendono la valutazione del danno neurologico tramite il test di Bederson, la valutazione della forza muscolare mediante il wire test, la valutazione della coordinazione e dell’equilibrio mediante il pole test, la valutazione del danno sensoriale mediante il corner test e infine la valutazione della sensibilità e il controllo del piccolo movimento mediante il sticky tape test (5).
Per quanto riguarda la valutazione cognitiva, i test sono stati eseguiti ogni settimana a partire dalla terza settimana dopo l’operazione per quattro settimane. I test scelti in questo caso sono stati l’Y maze e il novel object recognition test, che hanno permesso di valutare l’eventuale insorgenza di demenza post-ischemia sia per la memoria dichiarativa che non dichiarativa (6).
Al termine delle 6 settimane gli animali sono stati sacrificati e si è proceduto con l’analisi immunoistochimica per valutare il coinvolgimento di microglia, astrociti, infiammazione e neurogenesi in uno studio a lungo termine di danno ischemico cerebrale.
Sulle sezione di cervello ottenute in free floating mediante microtomo, sono stati eseguiti quattro diversi co-staining in immunofluorescenza:
- Neuronal Nuclei (NeuN) in associazione con Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA): in modo tale da poter indagare la neurogenesi in atto.
- Iba1 in associazione con Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP): per marcare microglia e astrociti.
- Doublecortin (DCX) in associazione con Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA): per consentire lo studio dei neuroni in movimento e della neurogenesi in seguito al danno subito.
- Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) in associazione con Glucose Transporter type 1 (Glut 1): in modo tale da poter individuare angiogenesi e neurogenesi in seguito al danno ischemico.
Durante l’analisi al microscopio di NeuN e PCNA è stato anche possibile attribuire un punteggio su una scala di quattro valori alla struttura ippocampale sulla base dell’estensione della lesione e del coinvolgimento di entrambi gli emisferi. Questa analisi ha permesso di correlare la lesione riscontrata a sei settimane dal danno ischemico con i risultati ottenuti dall’analisi comportamentale cognitiva a sei settimane.
Inoltre, dato che gli studi a breve termine in seguito a ischemia cerebrale, mostrano come l’emisfero colpito risulti di un volume notevolmente ridotto, a causa della morte del tessuto stesso, o più voluminoso, a causa dell’edema che coinvolge la zona, si è voluto indagare come si presenti, nel decorso a lungo termine, l’emisfero cerebrale colpito dal danno, rapportando i volumi dei due emisferi.
I risultati fino ad ora ottenuti hanno evidenziato un interessante ruolo del recettore CD36 nei confronti del danno indotto dalla lesione ischemica nel modello murino di MCAO utilizzato in questo studio. La prima fase della sperimentazione ha riguardato la valutazione del deficit motorio e cognitivo sviluppatosi a seguito della lesione, ponendo particolare attenzione alla valutazione a lungo termine. A tale scopo, è stato impiegato il Test di Bederson per la valutazione dell’estensione del danno, test motori come il Wire Test per studiare la forza degli animali dopo il processo ischemico e il Pole Test per osservare coordinazione ed equilibrio. Al fine di indagare la lesione nel contesto di percezione sensitiva sono stati applicati lo Sticky Tape Test e il Corner Test. I risultati ottenuti mostrano come la maggior parte di queste capacità risultino essere modulabili dal controllo del recettore CD36.
Per quanto riguarda la valutazione del deficit cognitivo sono stati utilizzati due test comportamentali che studiano la memoria non dichiarativa e dichiarativa, il Novel Object Recognition Test e il Y-Maze Test. In questo caso i dati ottenuti ad oggi non sono ancora sufficienti per poter affermare il ruolo di CD36 in questo determinato contesto. Ad ogni modo la correlazione ottenuta tra punteggio attribuito alla struttura ippocampale e i risultati ottenuti nei test cognitivi mostrano interessanti dati preliminari che pongono le basi per un ulteriore indagine in merito.
Dopo il sacrificio, i cervelli sono stati collezionati e sezionati al microtomo in maniera tale da ottenere quattro serie per cervello omogenee e sulle quali è in corso la valutazione per mezzo della tecnica immunoistochimica in fluorescenza. La valutazione è ancora in corso, risulta comunque interessante come, sebbene il danno sia esteso e presente anche negli animali transgenici, da un punto di vista prettamente anatomico la struttura dell’emisfero leso appare meglio conservata rispetto agli animali wild type, questo è indice della modulazione neuroprotettiva del recettore in esame.
Bibliografia
- Jackman K., Kunz A., Iadecola C., Modelling Focal Cerebral Ischemia In Vivo, Methods in Molecular Biology; vol. 793, 195-209, 2011.
- Kunz A., Abe T., et al.; Nuclear Factor-κB Activation and Postischemic Inflammation Are Suppressed in CD36-Null Mice after Middle Cerebral Artery Occlusion, J. Neurosci.; 28(07): 1649-1658, 2008.
- Cho S., CD36 as a therapeutic target for endothelial dysfunction in stroke, Curr. Pharm. Des.; 18(25): 3721-3730, 2012.
- Balkaya M., Kröber J., et al., Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia, J. Neurosci. Methods; 213, 179-187, 2013.
- Zhang L., Schallert T., et al., A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. J. Neurosci. Methods; 117, 207-214, 2004.
- Antunes M, Biale G., The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications, Cogn Process; 13:93-110, 2012.