RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA PREMIO “GENDER INNVATION”
Dott.ssa Ilaria Campesi
(Università di Sassari)
Relazione di metà periodo relativa al Premio Farmacologia di genere “Gender Innovation” della Dott.ssa Ilaria Campesi (Università di Sassari) “Influenza del determinante genere su EPC umane”
Nonostante l’influenza del sesso-genere nella fisiologia e patologia del sistema cardiovascolare sia stata ampiamente studiata (Wizemann, Pardue, 2001; Marino et al, 2011; Gregg et al, 2007, Pilote et al 2007; Mosca et al, 2011), esiste ancora una scarsa conoscenza riguardo ai fattori di rischio, la diagnosi, la prognosi e la risposta ai farmaci. L’identificazione di biomarker sesso-specifici diventa quindi rilevante e potrebbe aiutare a diagnosticare e predire gli eventi cardiovascolari o valutare la risposta ai farmaci, tenendo in considerazione le differenze di sesso-genere. Differenze di sesso-genere sono state descritte nei fattori di rischio e nei biomarker classici (Straface et al, 2010), mentre è stata scarsamente investigata l’influenza del sesso-genere SGD sui nuovi fattori di rischio di malattie cardiovascolari come l’infiammazione e la disfunzione endoteliale (Straface et al, 2010). Considerando che la disfunzione endoteliale è stata definita come “fattore di rischio integrato” (Bacon et al, 2011), la sua valutazione potrebbe avere una validità maggiore rispetto ai più tradizionali metodi di stratificazione del rischio. Diverse evidenze suggeriscono che le cellule progenitrici endoteliali (EPCs) costituiscono un importante sistema endogeno atto a mantenere l’integrità e l’omeostasi vascolare. Inoltre, la funzione delle EPCs (in termini di capacità migratoria e formazione di colonie) sembra essere controllata dagli estrogeni essendo influenzata dal ciclo mestruale, dalla menopausa e dalla terapia ormonale (Fadini et al 2008, Hoetzer et al 2007; Bulut et al 2007) e dall’esposizione ad alcuni inquinanti ambientali. Sta diventando, inoltre, sempre più chiaro come la capacità di formare colonie e la migrazione delle EPCs ex-vivo sia un marker indipendente della salute vascolare (Hoetzer et al 2007). Tuttavia, non è ancora stato chiarito se il numero e la funzione delle EPCs sia influenzata dalla variabile sesso-genere. Pertanto, lo scopo del progetto è stato quello di studiare l’influenza del sesso-genere sulle EPCs umane, in virtù del fatto che esse possono avere un valore prognostico, in quanto cambiamenti nelle EPCs circolanti possono riflettere condizioni di disfunzione endoteliale (Burgers, Touyz, 2012; Mallat et al, 2000).
Allo stato attuale sono stati reclutati giovani uomini e donne sani. I partecipanti allo studio non assumevano nessun farmaco, ad eccezione dei contraccettivi orali per le donne. Le EPCs circolanti sono state isolate e caratterizzate secondo Emanueli et al (2007). In breve, i leucociti totali sono stati isolati dal sangue intero mediante separazione in gradiente e le cellule coltivate in EBM-2 su piastre trattate con fibronectina. Dopo 7 giorni di coltura, le cellule sono state colorate con acetylated LDL (acLDL)-DiI e Ulex europaeus agglutinin-I (FITC)-coniugata ed esaminate attraverso un microscopio a fluorescenza. Le EPCs, identificate come cellule positive ad entrambi i coloranti, sono state utilizzate per il saggio di migrazione (Transwell assay): le cellule sono state seminate nella camera superiore di una camera di Boyden modificata (8.0 × 104 cells/well) e gli agenti chemotattatici in quella inferiore (17-β-estradiolo 10-9 M e 10-10 M e bisphenol A 10-8 M) per stimolare la migrazione. Le cellule sono state incubate per 24 ore a 37°C in 5% CO2. Successivamente le EPCs migrate sono state fissate e permeabilizzate con metanolo freddo per 5 minuti a temperatura ambiente, lavate con PBS e colorate cpn DAPI (0.2 mg/ml). I nuclei sono stati contati in 5 campi random con un microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 20X.
Gli uomini e le donne selezionati per lo studio non presentavano differenze significative in termini di età (31±2.5 anni per le donne and 31±5 anni per gli uomini), ma come atteso, gli uomini avevano un indice di massa corporea (BMI) significativamente superiore a quello delle donne (25±2.2 vs 19±1.2 rispettivamente; P<0.001).
Non sono state evidenziate differenze significative nella migrazione basale delle EPCs ottenute dagli uomini e donne. Quando le cellule sono state, invece, trattate con 17-β-estradiolo, è stata osservata una significativa differenza di genere nella capacità migratoria delle EPCs. In particolare, nelle EPCs provenienti dalle donne, concentrazioni fisiologiche di 17-β-estradiolo (10-9 M e 10-10 M) hanno provocato un significativo decremento della migrazione cellulare (calcolato come percentuale di cellule migrate rispetto al controllo) pari a circa il 50% per entrambe le dosi utilizzate (P<0.05 vs il controllo; P = 0.003 femmine verso maschi trattati con 17-β-estradiolo 10-9 M e P = 0.004 femmine verso maschi trattati con 17-β-estradiolo 10-10 M). Nelle EPCs degli uomini, invece, non è stato osservato nessun effetto statisticamente importante del 17-β-estradiolo sulla migrazione. È stato inoltre analizzato l’effetto del bisphenol A, un interferente endocrino ad attività estrogenica che sembra essere coinvolto nella patogenesi dell’obesità, del diabete mellito di tipo 2 e nelle malattie cardiovascolari, (Wei, 2009; Magliano, 2013) ed è stato osservato che il bisphenol A inibiva la migrazione solo nelle EPCs provenienti dalle donne sia rispetto al controllo che alle EPCs dei maschi ugualmente trattate (P<0.05 vs il controllo e P = 0.014 vs i maschi trattati con bisphenol A 10-8 M, rispettivamente). Infine, sono stati condotti esperimenti preliminari per capire quale isoforma dei recettori degli estrogeni possa mediare gli effetti del 17-β-estradiolo sulla capacità migratoria, utilizzando un inibitore del recettore degli estrogeni beta. Da queste prove sembrerebbe che l’effetto sia mediato dal recettore degli estrogeni beta, anche se sono necessari ulteriori approfondimenti a tale riguardo. In una fase successiva dello studio, oltre ad approfondire il discorso relativo alla funzione dei recettori degli estrogeni sulla migrazione delle EPCs, verrà analizzato il livello di espressione ed attività degli stessi, insieme ai processi di autofagia ed apoptosi. Quando, poi, il numero dei soggetti arruolati lo permetterà, verrà analizzato anche l’effetto del fumo di sigaretta sui parametri studiati, nonché l’influenza dell’assunzione di contraccettivi orali da parte delle donne, in quanto è già stato osservato che entrambi i fattori possono indurre significative variazioni nello stato infiammatorio cellulare e nell'espressione e attività dei recettori degli estrogeni (Campesi et al, 2012; 2013).
Il principale risultato ottenuto a questo punto dello studio riguarda il fatto che l’attività migratoria delle EPCs circolanti sia marcatamente inferiore nelle giovani donne sane rispetto agli uomini. Differenze di sesso-genere nelle EPCs potrebbero contribuire alle differenze di genere osservate nella funzione endoteliale e negli eventåi cardiovascolari. In particolare, la minore capacità migratoria delle EPCs derivate dalle donne potrebbe aiutare a spiegare la maggiore prevalenza di disfunzione endoteliale nelle donne, anche se lo studio necessità di un’analisi più dettagliata.
In conclusione una migliore conoscenza dei meccanismi che determina una diminuzione o una disfunzione nelle EPCs potrebbe dare nuove ed ulteriori conoscenze riguardo alla patogenesi delle malattie cardiovascolari e nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici.