RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott. Pignatelli Marco
Università di Roma "La Sapienza"
Relazione sul I periodo di ricerca all’estero con borsa di ricerca SIF del Dott. Marco Pignatelli
Istituto di appartenenza: Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia “V. Erspamer”, Università di Roma “Sapienza”.
Istituto ospitante: NIDA/NIH, Cellular neurobiology research branch-Synaptic plasticity section, Baltimore, USA).
La dipendenza da sostanze d’abuso riconosce un’ eziologia multifattoriale, da rintracciarsi nella interrelazione tra domini biologici, sociali e psicologici dell’individuo (Baron & Leshner, 2000). Le cause primarie che strutturano il disordine vedono come attori protagonisti la dimensione sociale da un lato, capace di dispensare le sostanze e il singolo individuo che esprime il comportamento di assunzione dall’altro. Il comportamento di assunzione rappresenta un atteggiamento maladattivo di determinati processi cognitivi del sistema nervoso centrale (SNC) dell’uomo orientati a porre in atto determinate condotte patologiche.
Negli ultimi decenni le neuroscienze, con il loro crescente carattere di interdisciplinarietà, hanno individuato come obiettivo nodale di studio alcuni tratti comportamentali che intercettano una specifica “vulnerabilità” del SNC nell’esprimere i suddetti comportamenti patologici (Vanyukov et al., 2003). In particolar modo recenti acquisizioni neuroscientifiche hanno posto in evidenza come uno dei comun denominatori di questa “vulnerabilità” del SNC nei riguardi della dipendenza da sostanze d’abuso sia rappresentato da un’ anomalo processo di apprendimento e memoria.
Premesso che il nostro SNC è una struttura ad alto potenziale “plastico”, adattabile cioè alle condizioni contestuali e prono all’apprendimento, le sostanze e i comportamenti d’abuso opererebbero insinuandosi nel potenziale plastico di alcune regioni cerebrali deputate al controllo del “decision making-problem analysis” (Es. Corteccia prefrontale) e in quelle che regolano la motivazione nei confronti di eventi gratificanti (Es. Area Ventrale del Tegmento) ,“wanting”, polarizzando in senso patologico la plasticità di queste regioni del sistema nervoso centrale ed alterandone il fine controllo omeostatico che le governa. Gran parte della ricerca di base sulla tematica della dipendenza da sostanze d’abuso si e’ avvalsa, come nel nostro caso, di modelli sperimentali murini che riproducono abbastanza fedelmente le stigmate sintomatologiche e comportamentali della condizione patologica umana.
Una delle più importanti e recenti acquisizioni sviluppate con l’impiego di animali da laboratorio (topi o ratti) è relativa al fatto che alcune sostanze d’abuso, come ad esempio la cocaina, sono in grado di elicitare una forma di memoria cellulare nota come Long-Term-Potentiation (LTP) nell’area ventrale del tegmento (Ventral Tegmental Area = VTA) sin dai primissimi tempi dall’esposizione. Questa memoria cellulare si sviluppa sin dal giorno seguente alla puntura intraperitoneale nel roditore, esposizione passiva, e puo’ perdurare per un intervallo di tempo duraturo, circa 5 giorni (Ungless MA et al., 2001). Sorprendentemente gli animali addestrati ad autosomministrarsi cocaina, esposizione attiva, sviluppano la stessa forma di memoria cellulare con la variante che in questo caso il processo plastico si mantiene per finestre temporali molto piu’ durature ,circa 3 mesi, che rappresentano un periodo di tempo molto vasto relativamente alla vita media di un animale da laboratorio (Chen BT et al., 2008).
Sulla scorta di queste osservazioni derivanti dalla somministrazione “passiva” e “attiva” di una sostanza d’abuso, quest’ultima piu’ prossima alla condizione umana, appare chiaro come i meccanismi cellulari e molecolari di apprendimento e memoria possano rappresentare il “core” fisiopatologico della dipendenza da sostanze d’abuso e pertanto richiamino un forte interesse applicativo-terapeutico.
La conoscenza dei piu’ fini dettagli molecolari sottostanti ai processi che supportano l’apprendimento associativo e la memoria ha il fine traslazionale di individuare potenziali “druggable targets”.
L'induzione del processo di apprendimento associativo e l'espressione della memoria risiedono nelle modificazioni "attività-dipendente" che occorrono a carico delle sinapsi eccitatorie ed inibitorie del SNC, regolamentate dai meccanismi di base che governano la "plasticità sinaptica"(Bliss TV, Collingridge GL., 1993).
Rievocare un'esperienza sensoriale o programmare delle procedure motorie dipende dalla abilita’ che le sinapsi del SNC hanno di generare un segnale su un rumore di fondo ("signal-to-noise") che deriva da un duraturo (a volte permanente) potenziamento o depressione della funzione sinaptica.
Sia il potenziamento che la depressione a lungo termine dell'attività sinaptica ("Long-Term Potentiation" o LTP e "Long-Term Depression" o LTD) possono essere indotte sperimentalmente stimolando ad alta o bassa frequenza vie afferenti di natura eccitatoria, emulando ciò che si crede accada in natura.
Le modificazioni attività-dipendente della funzione sinaptica dipendono in larga misura dall'attivazione dei recettori per il glutammato, il principale neurotrasmettitore eccitatorio del SNC. I recettori per il glutammato si dividono in due categorie: "ionotropici" e "metabotropici".
I recettori ionotropici formano canali ionici di membrana permeabili ai cationi mono- e bivalenti (Na+ e Ca2+) e sono a loro volta suddivisi in recettori AMPA, NMDA e kainato dal nome del ligando farmacologico che li attiva elettivamente.
I recettori AMPA ed i recettori NMDA sono i principali artefici dell'induzione dell'apprendimento associativo e della formazione della memoria
Nella maggior parte delle sinapsi, i recettori AMPA formano canali permeabili al Na+ ed impermeabili al Ca2+ per la presenza di una particolare subunità recettoriale (denominate GluR2) che contiene un residuo di arginina carico positivamente nella porzione del recettore che forma la parete del canale ionico.
I recettori NMDA sono invece permeabili al Ca2+, ma la loro attività è tonicamente inibita dagli ioni Mg2+, che vengono intrappolati all'interno del canale ionico.
L'attivazione dei recettori NMDA è resa possibile dalla depolarizzazione di membrana, che rimuove gli ioni Mg2+ dal canale ionico.
E' quanto si verifica durante l'induzione dell'apprendimento associativo, in cui uno stimolo non-condizionato (stimolo di rinforzo) in grado di depolarizzare la spina dendritica permette di apprendere lo stimolo condizionato.
Gli ioni Ca2 ++ che permeano attraverso il canale NMDA promuovono una serie di eventi intracellulari incentrati sull'attivazione di protein chinasi e/o di protein fosfatasi.
La prevalenza dell'attività delle protein chinasi produce LTP mentre la prevalenza dell'attività delle protein fosfatasi produce LTD.
L'attivazione di protein chinasi A, protein chinasi C e protein chinasi Ca2++-calmodulina dipendente di tipo II (CamKII) produce la fosforilazione di residui di serina e tronina dei recettori AMPA, che divengono maggiormente attivi e maggiormente espressi sulle membrane cellulari.
Ciò determina una maggiore risposta nei confronti dello stimolo condizionato, che viene dunque "identificato" rispetto agli stimoli afferenti e quindi "memorizzato".
L'attivazione delle protein fosfatasi riduce invece l'attività dei recettori AMPA e ne promuove i processi di internalizzazione indebolendo la funzione sinaptica e producendo LTD .
Pertanto, gli esecutori formali del potenziamento o della depressione della plasticita’ sinaptica sono i recettori AMPA.
In particolare e’ il numero di recettori AMPA espressi in membrana rispetto alle condizioni basali che determinera’ la bidirezionalita’ della plasticita’ sinaptica (LTP o LTD) (Malenka RC, Bear MF., 2004).
La transizione tra LTD e LTP ha come specifico descrittore la “metaplasticita” ,in buona sostanza la plasticita’ della “plasticita’ sinaptica”.
I gradi di liberta’ che puo’ assumere la metaplasticita’ variano a seconda del tipo di sinapsi, dello stadio di sviluppo, e della "storia funzionale" della sinapsi.
I neuroni dopaminergici che popolano la VTA esprimono costitutivamente recettori glutammatergici (sia ionotropici che metabotropici) e possiedono la machinery molecolare per poter sviluppare sia LTP e LTD in risposta alle opportune afferenze glutammatergiche reclutate durante i processi di apprendimento.
Dopo l’esposizione alla cocaina, sia passiva che attiva, nella VTA aumenta il contributo sinaptico dei recettori AMPA , valutato come AMPA/NMDA ratio, segno indiretto dell’ avvenuto fenomeno della LTP.
La dimostrazione elettrofisiologica dell’avvenuto fenomeno dell’LTP non chiarisce però la sua centralita’ nei riguardi dello sviluppo dei processi patoligici di dipendenza. Pertanto questa domanda biologica e’ rimasta a lungo tempo senza una opportune risposta.
Recentemente il gruppo di ricerca facente capo a Valina Dawson (Department of Neuroscience, Johns Hopkins University) ha caratterizzato una proteina capace di agire come ATPase in grado di operare la rimozione dei recettori AMPA esposti a livello sinaptico.
Questa proteina si chiama AAA+ATPase Thorase e sembrerebbe operare ,attraverso l’idrolisi di ATP, il disassemblamento del complesso GRIP1-AMPAR permettendo cosi’ la endocitosi dei recettori AMPA precedentemente esposti in membrana (Zhang J et al., 2011) .
Il gruppo di ricerca ha compiutamente dimostrato che la ablazione della AAA+ATPase Thorase abolisce la possibilita’ che avvenga il fisiologico riciclo recettoriale che riguarda i recettori AMPA, comportandone pertanto la immobilizzazione in membrana.
Questa condizione comporta una “rigidita’” nel sistema sinaptico che si impone all’espressione fisiologica della metaplasticita’. Gli animali KO per Thorase hanno una LTP costutivamente “satura” e l’impossibilita’ di sviluppare LTD, comportando sotto il profilo comportamentale specifici disturbi dell’apprendimento e della memoria, particolarmente in quei domini cognitivi ascrivibili alla formazione ippocampale.
La nostra ricerca sara’ tesa a chiarire come questa riduzione dei gradi di liberta’ metaplastici possa impattare sia il comportamento sinaptico che quello cognitivo dell’animale esposto passivamente alla cocaina.
Allo scopo di isolare funzionalmente il contributo di AAA+ ATPase Thorase nella sola VTA stiamo sviluppando una linea di animali disegnata ad hoc.
Per condurre una selettiva ablazione della proteina nei neuroni dopaminergici della VTA ci stiamo avvalendo dell’enorme potenziale offerto dal sistema Cre-ricombinasi (Morozov A., 2008; Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL., 2007).
Lo scopo di questa manipolazione e’ quello di lasciare imperturbate altre regioni cerebrali che potrebbero, qualora interessate dal deficit, rappresentare un fattore confodente (bias) dal punto di vista interpretativo.
Il sistema Cre-ricombinasi opera emulando alcuni meccanismi biologici ancestrali, riguardanti la ricombinazione del materiale genetico, che si sono dimostrati cruciali per la fitness adattiva di vari ed arcaici organismi.
Infatti, in alcuni organismi fileticamente inferiori esistono sistemi di ricombinazione sequenza-specifica.
Un esempio è presente nel fago P1, il quale si serve di una ricombinazione di questo tipo per depolimerizzare i concatenameri del suo genoma quando si replica nei batteri. Il sistema si basa su due elementi fondamentali: Cre, un'enzima ricombinasi e Lox, una sequenza agli estremi del genoma del fago. Cre riconosce in maniera specifica Lox ed ha bisogno di 2 sequenze lox per fare avvenire la ricombinazione. Sulle scorte di questo meccanismo risulta possible creare un topo transgenico avente il gene Cre e uno avente 2 sequenze Lox agli estremi di un gene che vogliamo analizzare.
Incrociando queste due line di topi si ottiene una progenie knockout condizionaleper il gene in studio. Un problema potrebbe sorgere dal fatto che alcuni geni risultano cruciali durante alcune precoci fasi embriogenetiche pertanto la loro delezione potrebbe comportare la generazione di animali disvitali.
Una soluzione a questo problema risiede nella possibilita’ di mettere a monte del gene di interesse un promotore cellula-specifico in maniera tale da inattivare il gene di interesse soltanto in determinati tessuti, senza comportare una delezione genetica globale che potrebbe strutturare problemi di natura embriologica. Ulteriore vantaggio speculativo di questo approccio risiede nella specifica risoluzione spaziale , anatomica, che la metodica consente
Lo sviluppo della nostra linea di animali prevede pertanto un breeding tra animali DATcre e animali ThoraseLox, sfruttando come linea direttrice il fatto che la cocaina ha come target farmacologico prototipico il trasportatore DAT e che quest’ultimo risulti fortemente espresso nelle popolazioni cellulari della VTA (solo parzialmente nella substantia nigra e nel retrorubral field ).
Le cellule esprimenti costitutivamente DATCre pertanto risulteranno KO condizionali (cKO) per la proteina Thorase.
La comprensione dei meccanismi fisiologici sottostanti il neural processing della VTA e le interconnessioni funzionali che questa contrae con le altre regioni cerebrali per la messa in opera degli “aspetti attivazionali della motivazione” sono da tempo oggetto di grande interesse della farmacologia.
La conprensione del contributo glutammatergico nella VTA e dei contenuti informativi relativi ai processi di apprendimento e memoria di cui questo si rende protagonista sono di estremo interesse nella prospettiva di un razionale sviluppo farmacologico.
Letteratura:
-Baron J., Leshner S. (2000) How serious are expressions of protected values? J Exp Psychol Appl; 6:183-94.
-Vanyukov, M.M., Kirisci, L., Tarter, R.E., Simkevitz, H.F., Kirillova, G.P., Maher, B.S., Clark, D.B. (2003) Liability to substance use disorders: 2.A measurement approach. Neurosci Biobehav Rev. 27(6):517-26.
-Ungless MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. (2001) Single cocaine exposure in vivo induces long-term
potentiation in dopamine neurons. Nature. 31;411(6837):583-7
-Chen BT, Bowers MS, Martin M, Hopf FW, Guillory AM, Carelli RM, Chou JK, Bonci A. (2008) Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 31;59:288-97.
-Bliss TV, Collingridge GL. (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 7;361:31-9.
-Malenka RC, Bear MF.(2004) LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 30;44:5-21.
-Zhang J, Wang Y, Chi Z, Keuss MJ, Pai YM, Kang HC, Shin JH, Bugayenko A, Wang H, Xiong Y, Pletnikov MV, Mattson MP, Dawson TM, Dawson VL. (2011) The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell.145:284-99.
-Morozov A. (2008) Conditional gene expression and targeting in neuroscience research. Curr Protoc Neurosci. Jul;Chapter 4:Unit 4.31.
-Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. (2007) Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 113:619-34.