Relazione sull’attività scientifica all’estero
Dott.ssa Maria Maddalena Valente
DiSCAFF & DFB Center, Laboratory of Neuroplasticity & Pain, Università del Piemonte Orientale
Relazione sulla prima parte dell’attività scientifica all’estero con borsa di ricerca SIF della Dott.ssa Maria Maddalena Valente (DiSCAFF & DFB Center, Laboratory of Neuroplasticity & Pain, Università del Piemonte Orientale).
Soggiorno all’estero presso “Department of Neuroscience, Georgetown University, Washington DC (USA)”.
Supervisori: Drs. Katherine Conant e Seung Lim.
“Studio e caratterizzazione di nuovi pathway coinvolti nella neurogenesi/sinaptogenesi di cellule staminali/progenitrici adulte”
Un vasto numero di evidenze sperimentali ci permettono di affermare come non solo durante lo sviluppo embrionale, ma anche nella vita adulta, nuovi neuroni si formino continuamente, dando vita al fenomeno noto come neurogenesi adulta. Nei mammiferi, compreso l’uomo, questo processo è altamente conservato, ma è ristretto a due specifiche aree cerebrali: SVZ e ippocampo (Alvarez-Buylla et al., 2001; Ming and Song, 2011). Sebbene il ruolo della neurogenesi adulta ippocampale debba essere tuttora chiarito, è noto che questo processo sia coinvolto in funzioni cognitive e emotive (Aimone et al., 2011) e che esso sia altamente deregolato in diversi disturbi neuropsichiatrici, come la depressione (Decarolis and Eisch, 2010). È altrettanto evidente come il trattamento di diversi primati, compreso l’uomo (Boldrini et al., 2009), con alcuni antidepressivi noti, possa regolare positivamente questo processo e migliorare i disturbi comportamentali legati a questa patologia. Questi dati sperimentali sono di grande interesse nella prospettiva di correggere, con farmaci che abbiano come target il processo di neurogenesi, funzioni cognitive ed emotive alterate in numerose patologie neuropsichiatriche.
Negli ultimi 10 anni si è andata consolidando l’idea che neuroni di nuova formazione nell’età adulta siano capaci di differenziare, maturare, migrare e infine integrarsi nel network ippocampale preesistente, diventando morfologicamente e funzionalmente indistinguibili dagli altri neuroni granulari (Mongiat e Schinder, 2011). Ciononostante, molto poco è attualmente noto riguardo i meccanismi alla base di questa integrazione e quanti poi siano i neuroni di nuova formazione effettivamente funzionanti. Nel periodo svolto presso la Georgetown University, sotto la supervisione del Dott. Seung Lim, abbiamo deciso di valutare se neuroni generati in età adulta siano capaci di formare sinapsi in vitro. Per rispondere a questi interrogativi, abbiamo innanzitutto valutato in vitro la coespressione di MAP-2, un marcatore di neuroni maturi, e di un tipico marcatore di densità post-sinaptica, PSD-95, in progenitori neurali adulti ippocampali di topo sottoposti a condizioni di differenziamento. In questo modello abbiamo dimostrato che a distanza di 48 ore dall’inizio del differenziamento i neuroni derivati dalle cellule NPC adulte esprimono entrambi i marcatori. Una volta caratterizzate queste cellule, il nostro successivo obiettivo sarà quello di valutare la loro effettiva capacità di formare sinapsi, sia in vitro che in vivo, sfruttando l’impiego di vettori lentivirali che promuovono, come quello che esprime BDNF, o reprimono, come cdh13, la sinaptogenesi. Durante i primi tre mesi di attività, mediante l’impiego di un protocollo già largamente utilizzato nel laboratorio del Dott. Seung (Tiscornia et al, 2006) abbiamo amplificato nella linea cellulare 293T e poi isolato, mediante ultracentrifugazione, vettori lentivirali esprimenti diverse proteine, tra cui la neurotrofina BDNF, noto promotore della neurogenesi, la caderina cdh13, che sembrerebbe reprimere la crescita assonale durante il differenziamento neuronale (Lee, 1996), e il suo shRNA, che, con un’efficienza intorno al 100%, ne blocca l’espressione. Dopo aver stabilizzato e selezionato, mediante trattamento con puromicina, progenitori neurali ippocampali infettati con questi vettori e con il vettore esprimente GFP, lo step successivo sarà quello di iniettare queste cellule nel topo, cosi da determinarne l’effettiva integrazione e funzionalità nei circuiti pre-esistenti. Per conseguire quest’obiettivo, sfrutteremo tecniche di elettrofisiologia, nonché tecniche di immunofluorescenza e biochimica.
In parallelo, sotto la supervisione della Dott.ssa Conant, stiamo valutando le proprietà proliferative e differenziative dei progenitori neurali ippocampali derivati da topi transgenici che iperesprimono la metalloproteinasi MMP1 sotto il controllo del promotore GFAP e dei rispettivi controlli wild type. Questa proteina e il suo recettore, PAR1, sembrano essere positivamente coinvolti in processi di angiogenesi e di crescita ed invasione metastatica (Boire et al, 2005). Intendiamo verificare il ruolo di MMP1 nella regolazione della neurogenesi ippocampale, valutando se i progenitori neurali derivanti da topi che iperesprimono questa metalloproteinasi sono in grado di proliferare di più rispetto alla controparte non modificata. Nel periodo trascorso, sono già state svolte alcune attività. Abbiamo innanzitutto dimostrato che MMP1 e il suo recettore sono espressi solo nelle cellule transgeniche. Successivamente, utilizzando un saggio di proliferazione e vitalità cellulare, abbiamo verificato che i progenitori neurali che iperesprimono MMP1 sono in grado di proliferare il 50% in più della loro controparte non mutata. Inoltre, in seguito al trattamento con un noto PAR1 antagonista, BMS-200261, siamo stati in grado di bloccare questa attività, e quindi di suggerire il coinvolgimento dell’asse MMP1-PAR1 negli effetti proliferativi osservati nelle cellule transgeniche. In seguito ci proponiamo di escludere o eventualmente confermare il coinvolgimento di altre vie del segnale, attraverso studi farmacologici. Approfondiremo infine eventuali differenze nelle capacità differenziative dei due ceppi: ad una prima analisi, a 24 ore di differenziamento, possiamo apprezzare un incremento delle cellule MAP2 positive, ovvero neuroni maturi, e una diminuzione dei precursori degli oligodendrociti, o cellule NG2 positive. Non osserviamo invece nessuna differenza nel numero di cellule astrocitarie, GFAP positive.
Bibliografia
- Alvarez-Buylla A, Garcia-Verduno JM, and Tramontin AD (2001) A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells. Nat Rev Neurosci 2: 287-293.
- Ming GL and Song H (2011) Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron 70: 687-702.
- Aimone JB, Deng W, and Gage FH (2011) Resolving new memories: a critical look at the dentate gyrus, adult neurogenesis, and pattern separation. Neuron 70: 589-596.
- DeCarolis NA and Eisch AJ (2010) Hippocampal neurogenesis as a target for the treatment of mental illness: a critical evaluation. Neuropharmacology 58: 884-893.
- Boldrini M, Underwood MD, Hen R, Rosoklija GB, Dwork AJ, John Mann J, and Arango V (2009) Antidepressants increase neural progenitor cells in the human hippocampus. Neuropsychopharmacology 34: 2376-2389.
- Mongiat LA and Schinder AF (2011) Adult neurogenesis and the plasticity of the dentate gyrus network. Eur. J. Neurosci. 33: 1055–1061.
- Tiscornia G, Singer O and Verma IM (2006) Production and purification of lentiviral vectors. Nature Protocols 1: 286-292.
- Lee SW (1996) H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nature Medicine 2: 776-782.
- Boire A, Covic L, Agarwal A, Jacques S, Sherifi S, Kuliopulos A (2005) PAR1 is a matrix metalloprotease-1 receptor that promotes invasion and tumorigenesis of breast cancer cell. Cell 120: 303-313.