RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Alma Martelli
Università degli Studi di Pisa
Relazione attività scientifica all’estero di metà mandato
Biomedical Research Centre Sheffield-Hallam University
Il solfuro d’idrogeno (H2S), una molecola gassosa che fin’ora era nota solo come agente tossico, sta emergendo quale modulatore endogeno che condivide con l’ossido d’azoto (NO) quasi tutti i suoi effetti benefici sul sistema cardiovascolare, senza però costituire una fonte di metabolici tossici. Al contrario, H2S mostra un profilo di antiossidante tipico dei solfuri organici ed inorganici, rivestendo così, realmente un ruolo di scavenger delle specie reattive dell’ossigeno. H2S viene sintetizzato in quantità apprezzabili, in molti tessuti dei mammiferi, grazie all’azione degli enzimi cistationina beta-sintasi (CBS) e cistationina gamma-liasi (CSE). In particolare CSE rappresenta la principale fonte di H2S nel sistema cardiovascolare.
Attualmente non disponiamo di una conoscenza esauriente di tutti i ruoli biologici esercitati da questo gas. Oltre ai meccanismi non specifici sopra descritti, ci sono però evidenze inconfutabili circa l’attivazione dei canali del potassio ATP-sensibili (KATP) quale target molecolare utilizzato da H2S per indurre il rilasciamento della muscolatura liscia vascolare. Questo meccanismo specifico sta alla base anche degli effetti cardioprotettivi esercitati da H2S contro il danno miocardico da ischemia/riperfusione. Sono stati ipotizzati altri meccanismi rilevanti, sia endotelio-dipendenti che endotelio-indipendenti ma la loro natura è ancora poco chiara. Infatti, H2S è in grado di inibire la proliferazione della muscolatura liscia vascolare e di contrastare l’aggregazione piastrinica sebbene attraverso meccanismi d’azione ancora da definire.
Per quanto riguarda l’implicazione fisiopatologica del “Sistema dell’H2S” endogeno, evidenze sperimentali suggeriscono che la sua alterazione contribuisca pesantemente alla patogenesi dell’ipertensione; analogamente, una diminuzione della biosintesi di H2S contribuisce all’instaurarsi di complicanze cardiovascolari osservate in modelli sperimentali di diabete mellito.
Da tali premesse emerge l’importanza di una modulazione farmacologica di questo sistema, attraverso lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici, ed in particolare di molecole in grado si rilasciare H2S esogeno e dunque sopperire alla sua carenza endogena, osservata in diversi stati patologici.
Inoltre l’evidente interazione fra H2S e le funzioni endoteliali suggerisce l’esistenza di un cross-talk fra H2S e NO. In particolare, dati recenti indicano una possibile correlazione fra l’alterazione del sistema dell’H2S e il progredire della condizione di disfunzione endoteliale. Le proprietà biologiche di H2S sono dunque un importante crocevia tra le caratteristiche di NO e il ruolo fisio-farmacologico dei canali del potassio; argomenti che rappresentano i temi fondamentali del lavoro di indagine scientifica da me condotta durante questi anni (Martelli et al., 2011).
Studi recenti da me condotti su anelli di aorta di ratto e cellule di muscolatura liscia di aorta umana sembrano tuttavia mettere in luce il possibile coinvolgimento di altri tipi di canali del potassio, oltre al KATP, nell’azione iperpolarizzante esercitata da donatori di H2S, in particolare mediante l’uso di bloccanti è stato possibile isolare una componente dell’azione vasorilasciante o iperpolarizzante riconducibile all’azione dei canali del potassio voltaggio operati (Kv). Durante questa prima parte del periodo di soggiorno all’estero mi sono dedicata all’apprendimento e alla messa a punto, su cellule HASMC (Human Aortic Smooth Muscle Cells), di una metodica altamente specifica già impiegata per lo studio di diversi tipi di canali del potassio, la tecnica dell’efflusso di Rubidio. La misurazione dell’efflusso di Rubidio rappresenta infatti uno strumento di indagine consolidato e riproducibile per la valutazione dell’attività dei canali del potassio. Infatti lo ione Rb+, che è una specie fisiologicamente non presente negli organismi animali, è considerato un “potassio-mimetico”, in quanto i canali al potassio (ed anche i vari trasportatori e scambiatori trans-membranali) presentano pressoché la medesima selettività per gli ioni K+ e Rb+. Pertanto i flussi trans-membranali di Rb+ esogeno sfruttano esclusivamente le medesime vie utilizzate fisiologicamente dal K+, come ad esempio i canali ionici K+-selettivi. La misurazione di tali flussi di Rb+ rappresenta dunque un indice selettivo e preciso dell’attività di tali canali. Tale principio è stato in passato ampiamente sfruttato mediante l’utilizzo di approcci radiometrici che prevedono l’impiego dell‘isotopo radioattivo 86Rb+ come tracciante dei flussi dello ione potassio.
Al contrario, la metodica messa a punto nel laboratorio di “Farmacologia dei canali ionici” del Biomedical Research Centre (Department of Biosciences, Sheffield Hallam University, UK), presso il quale sto svolgendo il soggiorno di studio all’estero, rappresenta un approccio più moderno e più versatile per studi farmacologici, poichè si basa sulla misurazione spettrometrica di assorbimento atomico del Rb+ e dunque non prevede l’utilizzo dei suoi isotopi radioattivi. In particolare, il protocollo sperimentale da me condotto in questa prima parte di soggiorno all’estero, prevede l’impiego della suddetta tecnica secondo due diversi approcci: uno “diretto” e l’altro “inverso”.
La prima metodica prevede che le colture cellulari di HASMC siano incubate in opportune soluzioni di Rb+, consentendo dunque che questo ione si concentri nel citosol, e siano quindi esposte ai trattamenti farmacologici in un secondo momento, finalizzati a influenzare il flusso out-ward dello ione. La seconda metodica prevede invece che gli apritori dei canali del potassio siano incubati nelle cellule contestualmente al buffer contenente Rb+, in questo caso, ciò che viene osservato è la capacità di tali molecole di indurre un maggior influsso di Rb+ all’interno delle HASMC. In entrambe le metodiche, al fine di individuare ed eventualmente escludere meccanismi di transito trans-membranario per il Rb+, alternativi ai canali del K+, gli esperimenti sono stati condotti anche in presenza di Ouabaina, quale bloccante della Na+/K+-ATP-asi. L’atomizzazione e la vaporizzazione su fiamma dei campioni (costituiti dai sovranatanti e dai lisati cellulari nel primo caso e dai soli lisati nel secondo), e la misurazione spettrometrica di assorbimento atomico alla lunghezza d’onda di 780.1 nm (specifica per l’atomo di Rb+) consentono quindi la valutazione qualitativa e quantitativa della concentrazione dell’elemento. La registrazione delle variazioni di concentrazione di Rb+ nei campioni è correlabile alle eventuali correnti di Rb+ attraverso canali al potassio e alla modulazione di tali canali ionici da parte dei trattamenti farmacologici.
Gli esperimenti condotti hanno consentito di evidenziare alcune caratteristiche delle HASMC in relazione ai meccanismi di accumulo ed estrusione dello ione Rb+; in particolare:
- Le HASMC pre-incubate con lo ione, mettono in atto efficaci e relativamente rapidi meccanismi di efflusso del Rb+, probabilmente legato a correnti mediate da canali del K+, attivi anche a livelli di “resting membrane potential”.
- L’utilizzo di attivatori farmacologici di canali del K+ (importanti a livello vascolare), quali i canali KATP e BK, non porta ad ulteriori variazioni della velocità e della cinetica dell’efflusso di Rb+;
- L’incubazione di HASMC in Rb+ è seguita da un rapido e quantitativamente rilevante accumulo dello ione nelle cellule;
- Tale accumulo è significativamente ridotto (ma non abolito) dall’Ouabaina, ed è quindi mediato in parte dalla Na+/K+-ATPasi;
- L’utilizzo contemporaneo di Ouabaina e bloccanti non selettivi di canali del K+ porta ad una marcata e quasi completa abolizione della captazione di Rb+, indicando il ruolo di canali del K attivi anche a livelli di “resting membrane potential”;
- Anche l’utilizzo contemporaneo di Ouabaina e Linopirdina, bloccante selettivo dei canali del K del tipo Kv7 porta ad una marcata e quasi completa abolizione della captazione di Rb+, indicando il ruolo di tale canale voltaggio-operato del K+ nel meccanismo di up-take di Rb+.
Esperimenti futuri saranno orientati alla valutazione del potenziale utilizzo di tale metodica per la caratterizzazione dei profili farmacodinamici di H2S e/o lo sviluppo di ulteriori approcci che prevedano il metodo spettrofotometrico con Rb+ in cellule transfettate ovvero l’utilizzo di tecniche elettrofisiologiche alternative.
Bibliografia
Martelli A., Testai L., Breschi M.C., Blandizzi C., Virdis A., Taddei S., Calderone V.“Hydrogen sulphide: Novel opportunity for drug discovery”.Medicinal Research Reviews, 2010 Published online: 7 Dec 2010 | DOI: 10.1002/med.20234