RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Anna Dellarole
Università del Piemonte Orientale - Facoltà Farmacia - Novara
RELAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA ALL’ESTERO SVOLTA PRESSO IL “MIAMI PROJECT TO CURE PARALYSIS”, MILLER SCHOOL OF MEDICINE, UNIVERSITY OF MIAMI – MIAMI - USA
Dott.ssa Anna Dellarole - Università del Piemonte Orientale - Facoltà Farmacia - Novara
SUPERVISORI:
Prof.ssa Mariagrazia Grilli
Prof. John R. Bethea
L’attività di ricerca svolta presso il Centro di Ricerca “Miami Project to Cure Paralysis” dell’Università di Miami ha consentito alla Dott.ssa Dellarole di apprendere le tecniche di stereologia e analisi morfometrica applicate a modelli di patologia del Sistema Nervoso sia Centrale (SNC) che Periferico (SNP). Obiettivo principale del periodo di lavoro all’estero è stato quello di integrare le conoscenze anatomo-patologiche e istologiche con metodologie che, insieme alle competenze neuropatologiche, di farmacologia comportamentale e di studio della neurogenesi in vivo apprese nelle precedenti esperienze lavorative, potessero essere applicate allo studio dei processi neurodegenerativi in modelli animali di patologia.
La stereologia è una tecnica estremamente rigorosa di conteggio cellulare da applicare ex-vivo in tessuti fissati. Attraverso questa tecnica si effettuano con elevata precisione ed accuratezza misurazioni del numero di cellule presenti in una data area di tessuto. Questo metodo consente anche un’analisi quantitativa delle diverse strutture cellulari (i.e. conta dei processi assonali, dendritici, dei nuclei, dei corpi cellulari) e di valutare le alterazioni morfologiche cui le cellule sono soggette in tessuti patologici. L’accuratezza della stereologia risiede nella possibilità di effettuare misurazioni assolute ovvero di contare il numero di cellule/processi presenti in un’intera struttura anatomica (i.e. ippocampo, cervelletto) attraverso il campionamento sistematico e casuale di sezioni della struttura stessa.
L’affiancamento di questa metodica a tecniche morfometriche di misurazione di perimetri, di aree e di volumi anatomici, consente di eseguire analisi esaustive di ciò che avviene in un tessuto patologico, rapportando per esempio la perdita neuronale ad alterazioni morfologiche micro- e macro-scopiche quali l’atrofia cerebrale conseguente alla perdita neuronale.
Inoltre le indagini neuropatologiche tradizionali consentono di valutare l’efficacia di una terapia in termini di riduzione delle lesioni caratteristiche della patologia, ma non forniscono informazioni sullo stato del tessuto cerebrale di per sè, qualora gli aspetti patologici risultino ridotti dal trattamento con farmaci. In questo senso la Stereologia e l’Analisi Morfometrica costituiscono metodi rigorosi che trovano sempre più vasta applicazione nello studio dei processi neurodegenerativi sia del SNC che SNP (West et al., 1999; Joelving et al., 2006). L’analisi stereologica inoltre è un metodo imprescindibile per lo studio della neurogenesi poiché rappresenta l’unico sistema affidabile per valutare attraverso il conteggio cellulare la proliferazione e il differenziamento dei precursori neuronali in nuovi neuroni.
Durante il soggiorno all’estero presso il Centro di Ricerca “Miami Project to Cure Paralysis” dell’Università di Miami le tecniche stereologiche e morfometriche sono state applicate a diversi modelli di neuropatologia ed in particolare:
3) un modello sperimentale di sclerosi multipla (MS) nel topo (MOG-specific EAE model);
4) il modello murino di dolore neuropatico CCI (Chronic Costriction Injury), ottenuto mediante legatura monolaterale del nervo sciatico.
La disponibilità di diversi modelli di patologia ha consentito di apprendere le tecniche di stereologia applicate all’analisi di tessuti diversi, quali il cervello e il midollo spinale a livello del SNC e le radici dei gangli dorsali a livello del SNP.
Al tal fine gli animali sono stati sacrificati mediante perfusione intracardiaca con paraformaldeide e dai tessuti congelati sono state prodotte, mediante taglio al criostato, sezioni seriate dello spessore di 50 micron (cervello e midollo spinale) o di 12 micron (gangli dorsali) per tutta l’estensione dell’area anatomica di interesse (i.e. ippocampo nel cervello) e si sono campionate una serie di sezioni egualmente spaziate (campionamento sistematico), scegliendo come prima sezione una a caso tra le prime dieci (campionamento casuale), secondo i criteri della stereologia (Gundersan and Jensen, 1987). Successivamente le sezioni sono state sottoposte ad analisi immunoistochimica con anticorpi in grado di riconoscere proteine espresse da specifiche popolazioni cellulari coinvolte nei processi neurodegenerativi, infiammatori, e/o neurogenici ed analizzate per il conteggio delle diverse sottopopolazioni mediante l’utilizzo del software StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA). Le aree di lesione e le misure dei volumi anatomici sono state eseguite sulle stesse sezioni mediante l’utilizzo del software Neurolucida (MicroBrightField, Williston, VT, USA).
L’ esperienza lavorativa condotta dalla Dott.ssa Dellarole nel laboratorio del Prof. John Bethea presso il “Miami Project to Cure Paralysis” è stata essenziale per estendere il suo bagaglio scientifico-culturale nell’analisi in vivo dei diversi aspetti dei processi neurodegenerativi applicati a modelli animali diversi sia a livello del SNC che SNP e le ha consentito di acquisire gli strumenti necessari per proseguire con la ricerca nel settore della neurofarmacologia applicata a modelli animali di patologia. Le metodiche di stereologia e analisi morfometrica, affiancate all’analisi neuropatologica potranno ora essere applicate a questi modelli con l’obiettivo di valutare l’efficacia di trattamenti farmacologici sulla regolazione dei processi neurodegenerativi piuttosto che sui meccanismi di neuroprotezione.
BIBLIOGRAFIA
- Gundersen HJ, Jensen EB. 1987. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147(Pt 3):229-63.
- Joelving FC, Billeskov R, Christensen JR, West M, Pakkenberg B. 2006. Hippocampal neuron and glial cell numbers in Parkinson's disease--a stereological study. 16(10):826-33.
- West MJ. 1999. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22: 51-61.