RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA
Dott.ssa CAPOCCIA ELENA
(Università Sapienza di Roma)
Relazione finale del periodo di studio trascorso all’estero con borsa SIF della Dr.ssa Elena Capoccia.
Istituto di provenienza: Department of Human Physiology and Pharmacology "V. Erspamer", Università Sapienza di Roma.
Istituto ospitante: Laboratory for Enteric NeuroScience (LENS) and Cell Imaging Core, KULeuven Translational research center for Gastrointestinal Disorders, Belgio.
BACKGROUND
Nel corso della prima parte degli esperimenti eseguiti, abbiamo dimostrato che la somministrazione intracolonica di HIV-1 Tat ha determinato in topi maschi Swiss, un instaurarsi di un quadro riferibile ad una diarrea secretoria, caratterizzata da aumento delle evacuazioni, con dispendio di elettroliti ed acqua nelle feci. A livello molecolare si è osservato un marcato incremento dell’espressione di parametri riferibili ad una gliosi enterica reattiva, con incremento dell’espressione delle proteine S100B ad iNOS concomitante un aumento dell’espressione dei recettori TLR-4 ed NF-kappaB. Già in precedenza avevamo dimostrato come la PEA determinasse attraverso in meccanismo PPARalfa dipendente, una riduzione dell’infiammazione colitica in un modello di rettocolite ulcerosa murina determinato dalla somministrazione di DSS al 4% (Esposito et al., Gut, 2014;63:1300-1312 ). Tale effetto era mediato da un antagonismo recettoriale a livello dei TLR-4 enterogliali con conseguente riduzione del rilascio di S100B. Sulla base di questi dati preliminari ottenuti abbiamo valutato l’effetto della somministrazione di palmitoiletanolamide, PEA (2-10mg/kg) nel modello di diarrea secretoria prodotto nel topo.
METODICHE SPERIMENTALI
In accordo al procedimento sperimentale descritto nella relazione precedente, in acuto abbiamo valutato l’effetto di PEA (2-10mg/kg) somministrata per via intraperitoneale nel corso della fase della diarrea secretoria indotta da clistere da HIV-1 Tat (1nM). Gli animali sono stati divisi nei seguenti gruppi sperimentali: (1) veicolo (soluzione fisiologica); (2) HIV-1 Tat (1nM); (3) HIV-1 Tat 1nM+ PEA 2 mg/Kg; (4) HIV-1 Tat 1nM+ PEA 10 mg/Kg; (5) HIV-1 Tat 1nM+ PEA 10 mg/Kg+MK886 10mg/kg; (6) HIV-1 Tat 1nM+ PEA 10 mg/Kg+GW9662 1mg/Kg. Si è valutato quindi: (a) il numero e la frequenza delle evacuazioni, (b) oltre all’accumulo di fluido nel lume intestinale. Alla fine del protocollo sperimentale eseguito, dopo eutanasia, si sono prelevati i sezionamenti di colon (3cm) per essere successivamente processati per indagini biochimiche, molecolari ed immunofluorescenza. Le analisi di western blot sono state utilizzate per quantificare l’espressione di GFAP (marker d’identificazione delle cellule gliali), S100B, TLR4 e iNOS unitamente ad analisi di immunofluorescenza attraverso microscopia confocale atta a quantificare la co-espressione di S100B-iNOS, per stimare l’entità del processo infiammatorio a livello intestinale.
RISULTATI OTTENUTI E PROSPETTIVE FUTURE
La PEA ha determinato nell’arco di tempo considerato nella sperimentazione in vivo, una riduzione della diarrea secretoria indotta da HIV-1 Tat nel topo. La PEA ha determinato nello specifico una riduzione marcata (-96%) della perdita di acqua nelle feci, congiuntamente ad una significativa riduzione della frequenza delle evacuazioni (-86%) nei topi trattati con HIV-1 Tat. L’azione farmacologica della PEA è risultata inibita dalla concomitante somministrazione dell’antagonista PPARalfa (MK866), ma non dall’antagonista PPARgamma (GW9662). A livello istologico tissutale, analisi post-mortem sui campionamenti colonici hanno dimostrato che la PEA, determina, attraverso un meccanismo dose-dipendente una riduzione dell’espressione di GFAP (-55%; -89%), iNOS (-46%, -90%) , S100B (-35% -67%), TLR-4 (-30%, 59%) e del rilascio di NO (-50% -80%) e di S100B (-41% -66%) nelle cellule enterogliali isolate dal colon distale prelevato dagli animali esposti a diarrea secretoria indotta da HIV-1 Tat. Nelle stesse condizioni, attraverso un meccanismo analogo dose e PPARalfa-dipendente, la PEA determinava una riduzione significativa dell’espressione di NF-KappaB (-35%-59%). Anche analisi di immunofluorescenza hanno rivelato una significativa e dose dipendente riduzione della coespressione enterogliale di S100B/iNOS nei plessi submucosali degli animali trattati con PEA (2-10mg/kg) vs il gruppo HIV-1 Tat (-56%, -112% rispettivamente). Sulla base di questi primi endpoints ottenuti, seppure nella fase in progress del lavoro di ricerca finora condotto, abbiamo risultati interessanti che ci dimostrano come la PEA, possa essere in grado di esercitare una riduzione secretoria della diarrea da HIV-Tat per effetto di una modulazione dell’attivazione enterogliale, e PPARalfa mediata nel topo. Sono in corso attualmente ulteriori studi, in via di definizione nel tentativo di approfondire l’effettivo potenziale e le implicazioni terapeutiche possibili nel corso di diarrea secretoria virale, e sul sistema endogeno di regolazione della produzione delle ALIA-midi ed in particolare della PEA.