RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA
Dott.ssa BIAGIOLI MICHELE
(Università di Perugia)
Borse di Studio per progetti di ricerca in ambito farmacologico bandite dalla SIF grazie al contributo incondizionato di MSD Italia.
Relazione di metà periodo sull’attività svolta dal Dott. Biagioli Michele (Dipartimento di Medicina, Sezione di Farmacologia, Università di Perugia)
TITOLO
Role of Glucocorticod-Induced Leucine Zipper (GILZ) in B cell development and growth
I glucocorticoidi (GC) sono farmaci ampiamente utilizzati come immunosoppressori e agenti antitumorali in alcune leucemie acute come nel mieloma multiplo. Alle dosi terapeutiche i GC inducono soppressione della crescita ed hanno effetti citotossici su vari tipi di leucociti tra cui i linfociti B. I meccanismi molecolari d’azione di tali farmaci dipendono per lo più dall’attività trascrizionale del recettore dei glucocorticoidi (GR) che modula l’espressione di numerosi geni bersaglio. Tra questi geni vi è GILZ, Glucocorticoid Induced Leucine –Zipper, che viene indotto dal trattamento dei GC e media molte delle azioni di questi farmaci tra cui la regolazione della differenziazione, della crescita e della morte cellulare. Nelle cellule T, GILZ modula le vie di trasduzione del segnale di Ras / MAPK / Erk e NFkB e promuove il segnale del TGF-β. GILZ appartiene alla famiglia TSC22d, con la quale condivide un dominio molto conservato chiamato TSC box, importante per la regolazione di Ras / MAPK / Erk. Uno dei geni membri di tale famiglia è stato recentemente trovato mutato in pazienti affetti da linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) suggerendo che anche i membri della famiglia TSC22d possono svolgere un ruolo importante nello sviluppo del linfoma.
Nel nostro lavoro, siamo andati quindi ad indagare il ruolo di GILZ nello sviluppo e nel differenziamento delle cellule B, avvalendoci, dei modelli murini del topo KO-totale per GILZ e del topo CD19 cKO per GILZ, quindi che presenta la delezione del gene solo nelle cellule B.
Per prima cosa abbiamo eseguito un’analisi del sangue su topi WT e KO per indagare se l’assenza di GILZ comportasse un’alterata ematopoiesi; nei topi giovani non abbiamo osservato differenze ma effettuando un monitoraggio a tempi diversi su topi in invecchiamento abbiamo potuto osservare che, all’incirca intorno al 6 mese di vita, i topi KO mostrano un aumentato numero di WBC (white blood cells) (nello specifico di linfociti) nel sangue se comparati con i valori ottenuti da topi WT della medesima età. Avanzando con l’età, negli animali analizzati, la differenza tra topi WT e KO aumenta con un ulteriore incremento del numero di WBC e Linfociti nei topi KO. Siamo quindi andati a studiare nei topi giovani WT e KO la composizione delle popolazioni di cellule presenti nel midollo osseo e in organi periferici quali la milza, i linfonodi e il sangue. Negli organi periferici non abbiamo osservato alcuna differenza tra animali WT e KO mentre a livello del midollo osseo abbiamo osservato un incremento delle cellule B sia in numero che in percentuale negli animali KO; mentre non abbiamo trovato differenze nelle altre popolazioni cellulari quali linfociti T, macrofagi e granulociti.
A questo punto siamo andati a caratterizzare meglio, mediante citofluorimetria, le diverse sottopopolazioni di cellule B presenti del midollo osseo, utilizzando come markers di superficie B220, CD43, IgM, IgD e cKIT che servono ad identificare le diverse popolazioni di cellule B presenti nel midollo osseo in modo da poter studiare da dove derivasse il difetto osservato. Queste analisi hanno rilevato un incremento in frequenza e numero delle popolazioni più differenziate quali PreB, Immature e Mature B nei topi KO se comparati con i WT mentre non vi sono differenze significative nei dati riguardanti le popolazioni più indifferenziate e cioè PreProB e ProB. Avendo osservato, come già detto in precedenza, un incremento delle WBC e dei linfociti nel sangue di topi KO vecchi siamo andati ad effettuare anche su tali animali l’analisi delle diverse popolazioni cellulari nel midollo osseo ma anche in periferia e quindi nella milza, nei linfonodi periferici e nel sangue. In questi animali abbiamo trovato un incremento di cellule B nel midollo come ci si poteva attendere visti i dati ottenuti nei topi giovani; inoltre abbiamo osservato un aumento delle cellule B anche negli organi periferici e nel sangue indicando che con l’aumentare dell’età degli animali il problema nei topi KO non risulta essere circoscritto solo al midollo osseo ma si presenta anche in periferia.
Il progetto proseguirà quindi con degli esperimenti volti a comprendere se l’accumulo di cellule B derivi da un incremento di proliferazione o da una diminuita apoptosi. Per rispondere a tale quesito andremo dunque ad analizzare la proliferazione nelle diverse sottopopolazioni di cellule B nel midollo di topi giovani mediante il marker Ki67 (proliferativo). L’apoptosi verrà valutata invece mediante Caspasi. Per indagare più a fondo questo aspetto andremo ad analizzare l’espressione delle caspasi anche mediante WB per confermare quanto osserveremo in citofluorimetria. Andremo quindi ad analizzare anche i livelli di espressione del gene Bcl2 nelle cellule B del midollo mediante qPCR, in quanto è un importante gene anti-apoptotico, e l’espressione dei geni pro-apoptotici della stessa famiglia quali Bim e Bax. Per essere sicuri che l’accumulo di cellule B che osserviamo sia B intrinseco inizieremo a svolgere alcuni esperimenti anche su topi cKO per GILZ nei quali il gene è deleto solo nelle cellule B.
Complessivamente, questo studio sarà utile per comprendere il ruolo dei GC e di GILZ nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule B normali e maligne. Le conoscenze ottenute nel presente progetto contribuirà a creare nuovi approcci terapeutici che utilizzino GILZ come un possibile obiettivo in patologie derivanti da linee cellulare B.